ΔΙΕΓΧΕΙΡΗΤΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ ΣΕ ΟΓΚΟΥΣ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ:

ΕΞΑΤΟΜΙΚΕΥΜΕΝΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΕΠΕΜΒΑΣΗ

ΑΚΡΩΝΥΜΙΟ: ΔΙΕΓΧΕΙΡΗΤΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ

ΚΩΔΙΚΟΣ ΕΡΓΟΥ Τ2ΕΔΚ-00971

Τίτλος (Αγγλικά) INTRAOPERATIVE FLOW CYTOMETRY IN BRAIN TUMORS:

PERSONALIZED SURGERY

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΠΡΟΤΑΣΗΣ

Το παρόν έργο αφορά το πεδίο πρωτοπαθών όγκων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και αποτελεί μία σημαντική προσπάθεια του Νευροχειρουργικού Ινστιτούτο Ιωαννίνων. Η επίπτωση των πρωτοπαθών όγκων του εγκεφάλου υπολογίζεται σε 7 με 19 περιπτώσεις ανά 100.000 ανθρώπους ανά έτος. Οι μεταστατικοί όγκοι εγκεφάλου είναι 10 φορές πιο συχνοί από τους πρωτοπαθείς. Οι πρωτοπαθείς όγκοι μπορεί να είναι καλοήθεις ή κακοήθεις. Η μέση επιβίωση των ασθενών με γλοιοβλάστωμα, τον συχνότερο πρωτοπαθές κακοήθη όγκο στους ενήλικες, είναι μόλις 15 μήνες. Ο βαθμός εξαίρεσης έχει προγνωστική σημασία. Διεγχειρητικά, ο χειρουργός ως σήμερα μπορεί μέσω της ταχείας βιοψία να έχει μια εκτίμηση για το βαθμό κακοήθειας των νεοπλασμάτων εγκεφάλου και των ορίων του όγκου. Ωστόσο, οι ταχείες βιοψίες έχουν πολλά μειονεκτήματα, όπως τομές χαμηλής ποιότητας, η τεχνική βασίζεται στην εμπειρία του παθολογοανατόμου, η προετοιμασία των δειγμάτων διαρκεί 5-10 λεπτά και δεν είναι επίσης λίγες οι φορές που μπορεί να υπάρχει και διαφορά μεταξύ της τελικής διάγνωσης και του πορίσματος της ταχείας βιοψίας. Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μια αυτοματοποιημένη μέθοδο ανάλυσης των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών κυττάρων και σωματιδίων, με βάση τη σκέδαση και το φθορισμό και με την προϋπόθεση το υπό έλεγχο δείγμα να βρίσκεται σε μορφή εναιωρήματος. Πρόσφατα, η ερευνητικοί εταίροι του έργου ανέπτυξαν ένα ταχύ πρωτόκολλο που δίνει την δυνατότητα ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου μέσα σε 6 λεπτά ("Ioannina Protocol"). Το γεγονός αυτό επιτρέπει τη διεγχειρητική ανάλυση του κυτταρικού κύκλου σε ένα χειρουργικό δείγμα. Με άξονα τα προαναφερθέντα επιστημονικά δεδομένα και την υπάρχουσα τεχνογνωσία των εταίρων του έργου στην πλατφόρμα κυτταρομετρίας ροής οι βασικοί στόχοι του έργου είναι η δημιουργία πρωτοτύπου προϊόντος που θα προσδιορίζει διεγχειρητικά εντός λίγων λεπτών, με βάση την κυτταρομετρία ροης τον τύπο του όγκου με βάση τον κυτταρικό κύκλο και τον ανοσοφαινότυπο και προσδιορισμό των ορίων του όγκου σε περιπτώσεις που απαιτείται. To έργο θα υλοποιηθεί σε τέσσερις ενότητες εργασίας οι οποίες αλληλεπικαλύπτονται και συνδυαζόμενες ουσιαστικά διαμορφώνουν τρεις φάσεις υλοποίησης: (i) ΦΑΣΗ ΤΕΛΙΚΗΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΩΝ, (ii) ΦΑΣΗ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ και (iii) ΦΑΣΗ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ. Οι 4 ενότητες εργασίας αποτελούνται από συνολικά 15 παραδοτέα τα οποία αφορούν το φυσικό αντικείμενο, την διαχείριση του έργου καθώς και σημαντικές ενέργειες διάχυσης. Η επιτυχής ολοκλήρωση του έργου θα συμβάλει τελικά: (i) στην δημιουργία συνολικά 5 νέων θέσεων εργασίας (5 πλήρους απασχόλησης), (ii) στην ενίσχυση των ερευνητικών φορέων με απόκτηση σύγχρονου εξοπλισμού (κυτταρομετρή ροής 8 παραμέτρων), (iii) στην παραγωγή δύο νέων καινοτόμων πρότυπων προϊόντων (Neuroflow Basic, Neuroflow Extended) τα οποίο αναμένεται να ενταχθούν στην παραγωγική διαδικασία του βιομηχανικού εταίρου εντός δύο ετών μετά το πέρας του έργου (μέσος όρος ολοκλήρωσης κλινικών μελετών και απόκτησης πιστοποίησης CE/IVD. Επιπλέον είναι ιδιαίτερα σημαντική τόσο η κλινική σημασία των αποτελεσμάτων του έργου, αφού η εφαρμογή της διεγχειρητικής κυτταρομετρίας ροής θα συμβάλει στην γρήγορη τυποποίηση των όγκων και στον ακριβή καθορισμό των ορίων όγκου, όσο και η ενίσχυση της τοπικής οικονομίας αφού ο μακροπρόθεσμος στόχος του έργου είναι η δημιουργία πρότυπου κέντρου αριστείας και εκπαίδευσης του επιστημονικού προσωπικού στην εφαρμογή της διεγχειρητικής κυτταρομετρίας ροής. Θα πρέπει να τονιστεί ότι το έργο θα συμβάλει σημαντικά στην ενίσχυση της εμπορικής και οικονομικής θέσης του βιομηχανικού εταίρου τόσο με άμεσα αποτελέσματα (ενίσχυση του τμήματος R&D, ένταξη στην παραγωγή ενός καινοτόμου προϊόντος υψηλής προστιθέμενης αξίας και χαμηλού ανταγωνισμού, ενεργή συμμετοχή σε επιστημονικά συνέδρια) όσο και με βραχυπρόθεσμα (ενίσχυση εξαγωγικού προσανατολισμού, διεύρυνση πελατολογίου, στόχος πωλήσεων >5 εκ. ευρώ σε βάθος πενταετίας μετά το πέρας του έργου). Τέλος είναι ιδιαίτερα σημαντική η ύπαρξη πλάνου διαχείρισης κινδύνου που εγγυάται την επιτυχή ολοκλήρωση του έργου τόσο ως προς τον επιστημονικό όσο και ως προς τον εμπορικό σχεδιασμό.

PROPOSAL ABSTRACT

The present work focuses on primary central nervous system tumors (CNS) tumors and is an important effort form the Neurosurgical Institute of Ioannina. The incidence of primary brain tumors is estimated at 7 to 19 cases per 100,000 people per year. Metastatic brain tumors are 10 times more common than primary tumors. Primary tumors may be benign or malignant. However, the average survival of the patients with glioblastoma, the most common and most malignant primary brain tumor, is only 15 months. Extent of resection has a prognostic significance in high-grade tumors and in certain low-grade tumors complete excision is curative. To date, surgeons are using frozen section biopsy for the determination of degree of brain tumor malignancy and tumor limits in breast cancer. However, frozen biopsies suffer from many drawbacks, such as low quality sections, the technique is based on the experience of the pathologist, turnaround time is usually 20-30 minutes, and there are also few times when there may be a difference between the final diagnosis and the diagnosis of the frozen section biopsy. Intraoperative MRI is limited in few centers worldwide and is associated with high cost, whereas intraoperative fluorescence guidance has been shown limited sensitivity and specificity in low-grade tumors. In high-grade tumors studies have showed cancer remnants is excision margins. Thus, new technologies are urgently needed. Flow cytometry is an automated method of analyzing the characteristics of cells and particles, based on scattering and fluorescence, and on condition that samples are in the form of a suspension. Recently, the research partners of the project developed a ground-breaking fast protocol that enables the cell cycle to be analyzed within 6 minutes ("Ioannina Protocol"). This allows for the intraoperative analysis of the cell cycle in a surgical specimen. This permits the identification of tumor margins in minutes and identification of specific brain tumor type in several cases based on immunophenotypic analysis. Based on the aforementioned scientific data and the existing project partners' know-how on the flow cytometry platform, the main objective of the project is to create a prototype product to determine intraoperatively within a few minutes, based on Flow cytometry, the type of brain tumor based on cell cycle and immunophenotype and more importantly tumor margins. The original product will be applied in "real time", allowing a continuous visualization of the tumor cells throughout the surgical procedure so that its effect can be utilized intraoperatively. The project will be completed in 4 sections that overlap and combine to form three phases of the project: (i) PROTOCOL ESTABLISHMENT, (ii) INDUSTRIAL RESEARCH PHASE and (iii) CLINICAL EVALUATION PHASE. The 4 sections consist of a total of 15 deliverables relating to the project’s main object, project management and diffusion activities. The successful completion of the project will ultimately contribute to: (i) the creation of a total of 5 new positions (5 full-time), (ii) support for research organizations by acquiring modern equipment (8- arameter cytometric flow, (iii) the production of two innovative prototype products (Neuroflow Basic, Neuroflow Extended) which are expected to be integrated into the manufacturing process of the industrial partner within two years after the end of the project (average completion of clinics trials and acquisition of CE/IVD certifications). In addition, the clinical significance of the project’s results are extremely important since the application of intraoperative flow cytometry will permit a rapid intraoperative diagnosis of the brain tumor type and identification of tumor margins. Furthermore, there will b ea strengthening of the local economy since the long-term objective of the project is to create a center of excellence and a center for training of scientific staff on intraoperative flow cytometry applications. Additionally, the project will make a significant contribution to strengthening the commercial and economic position of the industrial partner, both with direct results (strengthening the R & D division, integration and production of a new innovative product of high added value and low competition, active participation in scientific conferences) and short term (exports increase, increase of customers, sales target> 5 million in five years after the end of the project). Finally, it is particularly important to have a risk management plan that guarantees the successful completion of the project both in terms of scientific and commercial design.

Ανάπτυξη καινοτόμων διαγνωστικών εργαλείων για ανίχνευση και

χαρακτηρισμό Kυκλοφορούντων Kαρκινικών Kυττάρων (ΚΚΚ) στο αίμα των ασθενών.

ΑΚΡΩΝΥΜΙΟ JUNBlood

ΚΩΔΙΚΟΣ ΕΡΓΟΥ Τ2ΕΔΚ-01562

Τίτλος (Αγγλικά) Development of innovative diagnostic tools for the detection and

characterization of circulating tumor cells (CTCs) in patients' blood

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΠΡΟΤΑΣΗΣ

Το έργο αυτό στοχεύει στην ανάπτυξη ενός νέου αποτελεσματικού διαγνωστικού εργαλείου για την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό των Κυκλοφορούντων Καρκινικών Κυττάρων (ΚΚΚ) στο αίμα ασθενών με νεοπλασία. Η υγρή βιοψία είναι ταχέως αναπτυσσόμενο πεδίο και ανήκει στην μοντέρνα εξατομικευμένη προσέγγιση της θεραπευτικής του καρκίνου. Τα Κυκλοφορούντα Καρκινικά Κύτταρα (ΚΚΚ) είναι η ακρογωνιαία λίθος της υγρής βιοψίας. Πρόκειται για κύτταρα που εξέρχονται του πρωτοπαθούς όγκου πολύ νωρίς κατά την ογκογένεση μπαίνουν μέσα στα αγγεία και μεταναστεύουν σε άλλα όργανα, δημιουργώντας τις μεταστάσεις οι οποίες είναι κυρίως υπεύθυνες για την κακή έκβαση της νόσου. Είναι λοιπόν χρήσιμο να εντοπίζεται εγκαίρως η διασπορά των ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών. Επίσης τα ΚΚΚ διαθέτουν ιδιαίτερα φαινοτυπικά και μοριακά χαρακτηριστικά που τα καθιστούν ανθεκτικά στην συνήθη χημειοθεραπεία. Συγκεκριμένα πρόκειται για κύτταρα συνήθως μη πολλαπλασιαζόμενα, που συχνά έχουν απωλέσει των επιθηλιακό τους χαρακτήρα και επομένως βρίσκονται σε επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (EMT). Είναι λοιπόν αδύνατο να εντοπιστούν και να χαρακτηριστούν με επιθηλιακούς δείκτες όπως είναι οι Κυτταροκερατίνες που συνηθώς χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα. Από την άλλη πλευρά οι μεσεγχυματικοί δείκτες που έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων στο αίμα, όπως η βιμεντίνη, εκφράζονται σε πολύ μεγάλο ποσοστό στα κύτταρα του αίματος, καθιστώντας την διάκριση των ΚΚΚ αδύνατη μέσα στο δείγμα. Πρόσφατες μελέτες του εργαστηρίου μας σε ασθενείς με καρκίνο μαστού, ανέδειξαν ένα νέο συνδυασμό βιοδεικτών που μπορεί να χαρακτηρίσει αποτελεσματικά τα ΚΚΚ. Συγκεκριμένα η συνδυασμένη ανίχνευση του υποδοχέα χημειοκίνης CXCR4 και του μεταγραφικού παράγοντα JUNB μπορεί να διακρίνει αποτελεσματικά τα ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών. Ποσοτικοποίηση δε της έκφρασης των πρωτεϊνών αυτών έδειξε πως τα κύτταρα του αίματος εκφράζουν πολύ χαμηλά ποσοστά του μεταγραφικού παράγοντα καθιστώντας το JUNB ένα πολύ καλό βιοδείκτη για την αναγνώριση των καρκινικών κυττάρων στο αίμα. Επιπλέον εντοπίστηκαν σε περισσότερους από τους μισούς ασθενείς κύτταρα αρνητικά για κυτταροκερατίνες, αλλά θετικά για JUNB με χαρακτηριστικά νεοπλασματικών κυττάρων (ΚΚΚ), υποδηλώνοντας πως το JUNΒ είναι αποτελεσματικότερος βιοδείκτης από τις κυτταροκερατίνες. Επιπροσθέτως, ασθενείς που είχαν JUNB-θετικά KKK στο αίμα τους είχαν κακή πρόγνωση. Σκοπός λοιπόν του παρόντος έργου είναι: A) να διερευνηθεί με ανοσοφθορισμό και Real time PCR η παρουσία και η προγνωστική αξία της ύπαρξης CXC4/JUNB-θετικών KKK σε μία επιπλέον προοπτική ομάδα ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού, προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα παραπάνω ευρήματα. Β) να διερευνηθεί η χρησιμότητα της διαγνωστικής μεθόδου και σε άλλους τύπους καρκίνου, όπως αυτός του πνεύμονα (μικροκυτταρικός) ο οποίος είναι εξαιρετικά επιθετικός καθώς επίσης και σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Γ) τέλος θα διερευνηθεί ο συνεντοπισμός του JUNB και του PD-L1 στα ΚΚΚ με ανοσοφθορισμό και κυτταρομετρία ροής, προκειμένου να διερευνηθεί αν η ανίχνευση JUNB(+)/PD-L1(+) κυττάρων μπορεί να αποτελέσει ένα βιοδείκτη επιλογής ασθενών για ανοσοθεραπεία πέραν των συνήθων. Η μελέτη του συνδυασμού αυτού επιλέχθηκε διότι το PD-L1 επάγεται από τον JUNB και μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν δείξει πως τα μόρια PD-1/PD-L1 εκφράζονται στα ΚΚΚ και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για την ανοσοθεραπεία. Είναι άλλωστε γνωστό πως τα τελευταία χρόνια η ανοσοθεραπεία έχει επιφέρει επανάσταση στη θεραπεία πολλών τύπων καρκίνου συμπεριλαμβανομένου και του πνεύμονα.

Τα ΚΚΚ παρόλο που η προγνωστική τους αξία έχει τεκμηριωθεί πολλά χρόνια τώρα η κλινική τους χρήση είναι περιορισμένη και αυτό λόγω της δυσκολίας ανεύρεσης και χαρακτηρισμού τους. Το προτεινόμενο έργο λοιπόν έρχεται να διευκολύνει την ανίχνευση αυτών των κυττάρων με την χρήση νέων ειδικών βιοδεικτών γι’ αυτά τα κύτταρα και την δημιουργία ενός εύκολου διαγνωστικού τεστ που θα είναι απλό στην καθημερινή εργαστηριακή πρακτική.

PROPOSAL ABSTRACT

The aim of current study is to develop a new effective diagnostic tool for the isolation and characterization of Circulating Tumor Cells (CTCs) in the blood of cancer patients. The liquid biopsy is a rapidly developing field, belonging to the personalized approach of cancers treatment. The CTCs are the cornerstone of the liquid biopsy. These cells are leaving the primary tumor very early during tumorigenesis, entering the blood vessels and migrating to secondary organs, creating metastasis, which is mainly responsible for the poor outcome of the disease. Therefore the early detection of metastatic dissemination would be very useful for the patients. Furthermore CTCs hold and molecular features that make them resistant to standard chemotherapy Specifically, they are usually non-proliferating cells, they have often lost their epithelial characteristics and therefore CTCs are under epithelial to mesenchymal transition (EMT). Consequently it is impossible to identify and characterize these cells, using epithelial markers such as cytokeratins (commonly used today). On the other hand, the mesenchymal markers such as vimentin, which has been frequently used to detect cancer cells in the blood is also highly expressed in the blood cells, making the detection of tumor cells into the sample, very difficult. studies from our lab in breast cancer patients have revealed a new combination of biomarkers that can effectively characterize CTCs. In particular, the combined detection of the chemokine receptor and the transcription factor, JUNB can effectively discriminate CTCs in the blood stream. Quantification of this expression showed that blood cells express very low levels of JUNB, is a very good biomarker for the identification of cancer cells in the blood. In addition, more than half of the patients harbor cancer cells negative for cytokeratins and positive for JUNB, suggesting that JUNB is more effective biomarker than cytokeratins for the detection of CTCs.JUNB-positive CTCs was a poor prognostic factor for cancer patients. : A) to investigate by immunofluorescence and Real PCR experiments the presence and the predictive value of the existence CXCR4/JUNB-positive CTCs in a prospective and validation group of patients with metastatic breast cancer, in order to confirm the above findings B) to investigate the utility of this diagnostic method to another type of cancer such as lung cancer [(Small cell Lung Cancer (SCLC)] which is extremely aggressive and patients have very poor prognosis. The diagnostic value of the test will be also examined in patients with prostate cancer. C) to identify the co-localization of JUNB by immunofluorescence and flow cytometry experiments in order to define whether JUNB(+)/PD-L1(+) CTCs may represent a biomarker for the selection of patients for immunotherapy, since it has been reported that PD-L 1 is induced by JUNB and recent studies from our group have shown that can be used as biomarkers for immunotherapy. It is well known that immunotherapy has revolutionized the treatment of many types of solid tumors, including lung cancer.

Although the predictive value of CTCs has been documented many years now, their clinical utility is limited, due to the difficulty of their identification and characterization. Therefore the proposed project facilitates the detection of these cells by using new specific biomarkers for CTCs and creating an easy-to-use diagnostic test for everyday laboratory practice.

JUNBlood